关于质粒提取的那些事儿

虽然质粒提取是非常简单的操作，但是很多人对于其中的原理并非清楚。只知道在使用试剂盒的时候，加入溶液1，2，3，不知道溶液中含有的具体成分，也不清楚，每一种成分所起到的作用。

细胞中存在蛋白质，chromsomal DNA，plasmid DNA，RNA，我们的目的是把质粒DNA给提取出来，而且不能掺杂其他的生物大分子。蛋白质可以让它沉淀，RNA可以加入RNase降解，可以看出，质粒提取最关键的问题是如何把chromosomal DNA和plasmid DNA给区分开来。

细菌没有细胞核，只有一个拟核（nucleoid），chromosomal DNA是环状的，但是并非裸露的，上面结合有多种NAPs(nucleoid-associated proteins)。NAPs和基因转录活性可以改变拟核的形态结构。相对之下，plasmid DNA就要简单很多，游离于细胞质中，以共价闭环cccDNA（convalently closed circular DNA ）的形态存在。

图1 细菌拟核相关结构

质粒提取主要包括三个步骤：菌体扩繁、菌体裂解释放质粒DNA，和质粒DNA的分离与纯化。质粒提取主要有碱裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。

质粒提取方法中，最常用的是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特色。碱裂解法是根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构差异来分离的。其原理是：在强碱环境（pH12.0-12.6）下，细菌的细胞壁和细胞膜被SDS破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，宿主细胞的蛋白质、染色体及线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性（质粒DNA因为其分子量小而缠结严密不易变性）。虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性，但两条互补链仍会互相盘绕，并紧密的结合在一起。当加入pH4.8的乙醋酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快（可恢复天然构象），而线性的染色体DNA复性缓慢，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA（在高盐条件下，细胞碎片、变性的蛋白质和染色体DNA发生沉积，离心后可去除。上清中的质粒DNA可经过乙醇沉积或许硅胶膜特异性吸附等方法，将质粒DNA从上清中回收）。

总结来说，碱裂解法主要使用三种溶液（根据1979年J.Doly发表文章A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA,也就是经常说的碱裂解法)。The principle of alkaline extraction就是选择性地让chromosomal DNA发生变性，而plasmid DNA不会发生变性，仍然以双链形式存在。

在溶液Ⅰ中：Lysozyme可以溶解细胞壁，对于一些细胞壁比较厚的细菌，加入Lysozyme，是不错的选择，但是我们日常提取质粒的试剂盒似乎在溶液Ⅰ中没有添加Lysozyme。EDTA或者CDTA是金属离子螯合剂，能够螯合Ca2+、Mg2+等二价金属离子。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，细胞壁最外层是脂多糖LPS，携带负电荷。要维系LPS的稳定性，必须要有足够多的Ca2+。如果用EDTA螯合掉Ca2+，就会使LPS解体，暴露出内层的肽聚糖，因而容易被Lysozyme水解。Ca2+、Mg2+也是细胞膜的重要成分，同时，对于细胞内很多酶的活性至关重要。EDTA可以破坏细胞膜，抑制细胞内许多酶的活性，比如核酸酶，防止DNA被降解掉。Glucose可以给细胞一个osmotic shock(渗透压)，导致细胞壁和细胞膜裂解，还有一种说法，Glucose可以增加溶液的黏稠度。使细胞不至于快速沉降。J.Doly文章只提到一句，用Glucose可以更精确控制溶液PH，不太明白其中的原理。

在溶液Ⅱ中：SDS能够破坏细胞壁，让细胞内容物(Lysate)释放出来，还可以使蛋白变性，性，结合到蛋白质表面。在这个过程中，chromosomal DNA会被降解成线性片段，一旦遇到强碱（12.0-12.5），chromosomal DNA会发生变性分离变成单链，但是plasmid DNA对此PH范围耐受，仍然以双链形式存在。

在溶液Ⅲ中：加入醋酸钠可以中和强碱，chromosomal DNA发生复性，但是无法恢复原来天然的双链结构，而是形成一团缠绕在一起无法溶解的网状结构。高浓度的钠盐溶液可以让SDS-protein-chromosomal DNA复合物沉淀析出。接来下通过高速离心，SDS-protein-chromosomal DNA复合物，其他的细胞裂解物全部沉淀管底，只有plasmid DNA溶解在上清中。

大，小和中提的区别和应用

质粒抽提按得到质粒DNA的量可分为小提，中提，大提。

质粒小提用的菌液量很少，一般1-5ml，提出的质粒DNA量较少，其特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得DNA有一定纯度，此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等对质粒浓度要求不高的实验。维真生物采用高通量小提试剂盒，从1ml菌液中提取质粒，用90ul洗脱液洗脱得到的质粒浓度为100-200ng/ul，可以满足大部分实验要求，也可以直接用于一般的腺病毒包装，不过维真生物慢病毒、腺相关病毒（AAV）包装一般使用大提试剂盒进行抽提，以保证高滴度及稳定的质量。

质粒中提得到的质粒DNA的量介于小提跟大提之间，一般用30-50ml菌液提取，提取的质粒可用于包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。从50ml菌液中提取质粒可到到500ul质粒浓度为0.7-1ug/ul的质粒。

质粒大提是质粒大量提取的简称，有些实验室称之为大抽。质粒大提用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，大规模地从细菌中将扩增的质粒提取出来。一般的大提质粒试剂盒都是使用纯化柱，提取出来的质粒纯度高，杂质少，无内毒素，一般用于细胞的转染等对质粒纯度高的实验。从200ml菌液中提取质粒，1000ul洗脱液洗脱后得到的质粒浓度为0.5-2ug/ul。维真生物慢病毒、腺相关病毒（AAV）包装一般使用大提试剂盒进行抽提，以保证高滴度及稳定的质量。

注：在一个细菌细胞中只有5个以下的相同质粒时，该质粒是低拷贝质粒；当在一个细菌细胞中可以有几百个相同质粒时则该质粒是高拷贝质粒。低拷贝质粒在等量的菌体中的数量远低于高拷贝质粒，因此用等量菌体提取质粒时，提取的低拷贝质粒的浓度会很低。维真生物的过表达载体是低拷贝质粒，对于此类质粒载体，若需要大量质粒或者小提质粒的实验效果不好时，则需要加大提取的菌体量，可进行质粒中提或者大提，另外，使用去内毒素的试剂盒抽提质粒时，也会降低最终得到质粒的浓度。

注：感受态菌株是模式菌株，没有质粒，是为了扩增目的质粒而生的，否则再转化进目的质粒后就会混合了。